O microscópio óptico é um instrumento usado para ampliar e regular, com uma série de lentes multicoloridas e ultravioleta capazes de enxergar através da luz, estruturas pequenas e grandes impossíveis de visualizar a olho nu.
É constituído por uma parte mecânica que suporta e permite controlar e por uma parte óptica que amplia as imagens.
Composição óptica de um microscópio óptico:
Condensador e DiafragmaO Condensador é um Conjunto de duas ou mais lentes convergentes que orientam e espalham regularmente a luz emitida pela fonte luminosa sobre o campo de visão do microscópio.
O Diafragma é constituído por palhetas que podem ser aproximadas ou afastadas do centro através de uma alavanca ou parafuso, permitindo regular a intensidade da luz que incide no campo de visão do microscópio.
Lentes ObjectivasPermitem ampliar a imagem do objecto 10x, 40x, 50x, 90x ou 100x. Existem:
As objectivas de 10x, 40x e 50x são designadas objectivas secas pois entre a preparação e a objectiva existe somente ar.
As objectivas de imersão, uma vez que, para as utilizar, é necessário colocar uma gota de óleo de imersão entre elas e a preparação, o qual, por ter um índice de refracção semelhante ao do vidro, evita o desvio do feixe luminoso para fora da objectiva.
Lentes OcularesSistema de lentes que permitem ampliar a imagem real fornecida pela objectiva, formando uma imagem virtual que se situa a aproximadamente 25 cm dos olhos do observador. As oculares mais utilizadas são as de ampliação 10x, mas nos microscópios binoculares também existem oculares de 12,5, 8x e 6x.
A Microscopia Óptica pode ser de três maneiras diferentes, são elas:
Microscopia de fundo escuro
É uma aplicação do princípio de Tyndall. Assim os corpúsculos a examinar são fortemente iluminados por feixes luminosos que penetram lateralmente, o que é conseguido com condensadores especiais. Deste modo, a única luz que penetra na objectiva é a difractada pelas partículas presentes na preparação, pelo que passam a ser visíveis em fundo escuro também.
Microscopia de fluorescência
Permite observar microorganismos capazes de fixar substâncias fluorescentes (fluorocromos). A luz UV, ao incidir nessas partículas, provoca a emissão de luz visível e observa-se os microorganismos a brilhar em fundo escuro. Como exemplo, o bacilo da tuberculose fixa a auramina, pelo que o diagnóstico da doença pode ser feito por microscopia de fluorescência.
Microscopia de contraste de fase
Permite visualização de microrganismos vivos, sem coloração, através do contraste devido à diferença de fase dos raios luminosos que atravessam o fundo relativamente à fase da luz que atravessa os microrganismos. Esta diferença de fase é conseguida por utilização de uma objectiva de fase, que consiste num disco de vidro com um escavação circular, de modo que a luz que atravessa a escavação tem diferença de 1/4 de fase em relação à que travessa a outra porção do vidro. Assim, os objectos não corados podem funcionar como verdadeiras redes de difracção, pois os pormenores da sua estrutura resultam de pequenas diferenças nos índices de refracção dos componentes celulares, e estes originam diferenças de fase nas radiações que os atravessam.
Microscópio eletrônico de transmissão
Um microscópio eletrônico de transmissão (MET) é uma técnica de microscopia na qual um feixe de elétrons é emitido em direção a uma amostra ultra fina, interagindo com a amostra enquanto a atravessa. A interação dos elétrons transmitidos através da amostra forma uma imagem que é ampliada e focada em um dispositivo de imagem, como uma tela fluorescente em uma camada de filme fotográfico, ou detectada por um sensor como uma câmera.
Um MET é capaz de exibir imagens a uma resolução significativamente maior em comparação com os microscópios óticos devido ao pequeno comprimento de onda dos elétrons. Tal característica permite ao usuário examinar detalhes ínfimos, até mesmo uma simples coluna de átomos, a qual é dezenas de milhares vezes menor do que o menor objeto reconhecível em um microscópio ótico. O MET é um dos principais métodos de análise em uma vasta gama de campos científicos, tanto em ciências físicas quanto biológicas. O MET é aplicado na pesquisa do câncer, virologia e na ciência dos materiais, além das pesquisas de poluição, nanotecnologia e semicondutores.
A pequenas ampliações, o (contraste) na imagem deve-se à absorção de elétrons pelo material, como consequência da sua espessura e composição.A ampliações maiores, a intensidade da imagem é resultante de um conjunto complexo de interações de ondas, o que requer a análise das imagens obtidas por parte de peritos. A alternância entre estas formas de uso permite observar através do MET modulações na composição química, orientação de cristais, estrutura eletrônica e a indução da mudança da fase eletrônica bem como as comuns imagens baseadas na absorção do material.
O primeiro MET foi construído por Max Knoll e Ernst Ruska em 1931, parte do grupo que desenvolveria o primeiro MET com poder de resolução superior ao da luz em 1933 e o primeiro TEM comercial em 1939.
Não é possível observar material vivo neste tipo de microscópio. O material a ser estudado passa por um complexo processo de desidratação, fixação e inclusão em resinas especiais, muito duras, que permitem cortes ultrafinos obtidos através das navalhas de vidro do instrumento conhecido como ultramicrótomo.
Uma imagem obtida a partir do MET. O vírus da poliomelite mede 30 nm.
Microscópio eletrônico de varredura
O microscópio eletrônico de varredura (português brasileiro) ou microscópio eletrónico de varrimento (português europeu) (MEV) é um tipo de microscópio eletrônico capaz de produzir imagens de alta resolução da superfície de uma amostra. Devido a maneira com que as imagens são criadas, imagens de MEV tem uma aparência tridimensional característica e são úteis para avaliar a estrutura superficial de uma dada amostra.
Índice
O processo de varredura
Em um MEV típico, os elétrons são emitidos termionicamente a partir de um cátodo (filamento) de tungstênio ou hexaboreto de lantânio (LaB6) e acelerados através de um ânodo, sendo também possível obter elétrons por efeito de emissão de campo. O tungstênio é tipicamente usado por ser o metal com mais alto ponto de fusão e mais baixa pressão de vapor, permitindo que seja aquecido para a emissão de elétrons. O feixe de elétrons, o qual normalmente têm uma energia que vai desde as algumas centenas de eV até 100keV, é focalizado por uma ou duas lentes condensadoras, em um feixe com um ponto focal muito fino, com tamanho variando de 0,4 a 0,5 nm. Este feixe passa através de pares de bobinas de varredura e pares de placas de deflexão na coluna do microscópio.
Tipicamente as lentes objetivas, as quais defletem o feixe horizontal e verticalmente para que ele varra uma área retangular da superfície da amostra.
Quando o feixe primário interage com a amostra, os elétrons perdem energia por dispersão e absorsão em um volume em forma de gota, conhecido como volume de interação, o qual se estende de menos de 100 nm até em torno de 5 µm para dentro da superfície da amostra. O tamanho do volume de interação depende da energia dos elétrons, do número atômico dos átomos da amostra e da densidade da amostra. A interação entre o feixe de elétrons e a amostra resulta na emissão de elétrons secundários, elétrons retroespalhados, elétrons Auger, raios-x Bremstralung, raios-x característicos, radiação eletromagnética na região do infravermelho, do visível e do ultravioleta, fônons além de causar aquecimento da amostra.
O microscópio eletrônico de varredura (MEV) é um equipamento capaz de produzir imagens de alta ampliação (até 300.000 x) e resolução. As imagens fornecidas pelo MEV possuem um caráter virtual, pois o que é visualizado no monitor do aparelho é a transcodificação da energia emitida pelos elétrons, ao contrário da radiação de luz a qual estamos habitualmente acostumados. O princípio de funcionamento do MEV consiste na emissão de feixes de elétrons por um filamento capilar de tungstênio (eletrodo negativo), mediante a aplicação de uma diferença de potencial que pode variar de 0,5 a 30 KV. Essa variação de voltagem permite a variação da aceleração dos elétrons, e também provoca o aquecimento do filamento. A parte positiva em relação ao filamento do microscópio (eletrodo positivo) atrai fortemente os elétrons gerados, resultando numa aceleração em direção ao eletrodo positivo. A correção do percurso dos feixes é realizada pelas lentes condensadoras que alinham os feixes em direção à abertura da objetiva. A objetiva ajusta o foco dos feixes de elétrons antes dos elétrons atingirem a amostra analisada.
Estes grãos de pólem tomados em um MEV mostram a característica de profundidade de campo das micrografias de MEV.
Câmara de amostras de um MEV aberta
Preparação de amostras
Espécimes de metal não exigem nenhuma preparação especial, a não ser cortes para caber na câmara de amostras e algum seccionamento se necessário.
Espécimes sólidos não condutivos devem ser cobertos com uma camada de material condutivo, exceto quando observados com Ambiente de Vácuo Variável. Uma cobertura ultrafina de material eletricamente condutiva é depositada tanto por evaporação de alto vácuo quanto por sputter de baixo vácuo na amostra. Isto é feito para prevenir a acumulação de campos elétricos estáticos no espécime devido irradiação elétrica durante a produção da imagem. Tais coberturas incluem ouro, ouro/paládio, platina, tungstênio, grafite, etc. Outra razão para a metalização, mesmo quando há condução mais do que suficiente, é para melhorar o contraste, está situação é mais comum na operação de microscópios eletrônicos de varredura por emissão de campo.
Embutindo em uma resina e polimento com acabamento espelhado pode ser benéfico para ambas amostras, tanto biológicas quanto materiais, especialmente quando imagens por elétrons retro espalhados (backscatterd) ou microanálises por raios X são feitas.
Uma amostra biológica necessita fixação para preservar sua estrutura, que é usualmente feita com a incubação da amostra em solução fixadora, como glutaraldeído ou formaldeído.
Se não usada em ESEM, amostras biológicas devem ser desidratadas, usualmente substituindo água por solventes orgânicos como etanol ou acetona, e então removendo os solventes.
Se o MEV for equipado com cryo-microscopia, então cryofixação pode ser usada. Cryofixação - congelando o espécime tão rápido, à temperaturas de nitrogenio líquido ou mesmo hélio líquido, que a água forma de gelo vítreo (não cristalino). Isto preserva o espécime em uma tomada de seu estado dissolvido. Um campo inteiro chamado microscopia cryo-electrônica ramificou a partir desta técnica. Com o desenvolvimento da microscopia cryo-eletrônica de seções vítreas, é agora possível observar virtualmente qualquer amostra biológica próximo de seu estado nativo.
Outra cryo-técnica para amostras biológicas é a cryo-fratura, quando a amostra congelada é fraturadoa com uma aparato especial, metalizada e trasnferida para o cryo-holder enquanto permance congelada.
Data a falta de informação, metalização com ouro é até um processo semi-destrutiva desde que remover a camada de ouro quimicamente requer químicos agressivos como cianeto de potássio ou áqua régia.
Técnicas alternativas, por exemplo baixo vácuo MEV ambiental, permite a visualização de amostras sem metalização e sem a perda do contraste natural vindo da interação feixe-amostra. Ouro tem um alto número atômico e produz alto contraste topográfico e resolução mas a informação uma vez produzida pode ficar obscura e esconder detalhes finos da amostra sendo examinada.
Fonte: www.google.com.br
BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR, de JUNQUEIRA e CARNEIRO
Realizado pelos alunos Claudson Moreira e Tatiane Vitorino
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